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去除胞外多聚物(eps)对大肠杆菌转化和接合效率的影响(附件)

2021-07-03 23:35编辑: www.51jrft.com51今日论文网
[目的]研究去除胞外多聚物(EPS)对大肠杆菌转化和三亲接合效率的影响。[方法]本文采用超声法去除大肠杆菌的胞外多聚物,比较是否去除胞外多聚物后的大肠杆菌转化和三亲接合效率的不同。[结果]结果表明,去除胞外多聚物可以良好促进大肠杆菌的转化和三亲接合,显著提高大肠杆菌的转化和三亲接合效率。在去除胞外多聚物后转化效率提高了88.90%,三亲接合效率提高了24.54%。[结论]去除胞外多聚物有利于大肠杆菌的转化和三亲接合,相较于去除胞外多聚物后对三亲接合效率的小幅提升,去除胞外多聚物可以极大程度地促进大肠杆菌吸收外源质粒,促进大肠杆菌的转化。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言(或绪论)1
1 材料与方法2
1.1化学试剂与培养基2
1.2所用菌株的抗生素抗性检验2
1.3大肠杆菌三亲接合实验2
1.3.1供试菌株抗性选择标记2
1.3.2 菌悬液的制备和胞外多聚物(EPS)的去除3
1.3.3 去除EPS对大肠杆菌致死率的影响3
1.3.4 去除EPS过程中所得上清液的组分定量3
1.3.5 三亲接合4
1.3.6 三亲接合的菌液稀释涂布4
1.3.7 三亲接合的数据整理和结果计算4
1.4 大肠杆菌的转化实验4
1.4.1 供试菌株抗性选择标记 4
1.4.2 大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)4
1.4.3 热激法转化感受态细胞4
1.4.4 转化液的稀释涂布5
1.4.5 转化的数据整理和结果计算5
1.5 质粒提取及酶切验证5
1.5.1 质粒提取5
1.5.2 质粒酶切验证5
2 结果与分析 6
2.1 受体菌株的抗生素抗性6
2.2 去除EPS过程对受体细菌的致死率6
2.3 接合效率6
2.3.1 阳性接合子的荧光检测6
2.3.2 接合效率7
2.4 转化效率7 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ^351916072

2.5 上清液成分测定结果7
2.5.1 多糖含量7
2.5.2 蛋白质含量7
2.6 质粒验证结果8
3. 讨论8
致谢9
参考文献9
去除胞外多聚物(EPS)对大肠杆菌转化和接合效率的影响
引言
引言
细菌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是指附着在细菌表面或围绕在细菌周围,水道、孔隙穿通其间,形成蘑菇状膜结构,用于自我保护和相互粘附的天然有机物[1]。EPS在细菌微生物群体中广泛存在,对细菌的粘附聚集、空间构型、细菌间信息交流、耐药性、抗毒性及细菌与外界物质的吸附、沉降、絮凝、脱水等各方面,都起着重要作用。
由于EPS独特的性质,引起了越来越多的研究者的重视,并且很多研究成果在工程上得到了广泛的应用。如在矿物加工工业中,利用EPS作抑制剂浮选硫化矿;在环境工程中,利用其处理废水和污泥[2]等;在食品工业上,用作食品添加剂和保鲜剂等;在生物医学上,被用于疾病预防和保健等[3]。因而具有较高的研究和实用价值。
大肠杆菌(Escherichia coli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周生鞭毛,能运动,无芽孢。E. coli基因组中还包含有许多插入序列,如λ噬菌体片段和一些其他特殊组分的片段,这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的,由此表明了基因组具有可塑性。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造,在基因工程的研究和生产中具有广泛的应用价值[4]。
作为微生物技术领域最常用的外源基因表达的宿主菌之一,大肠杆菌遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,基因组DNA为拟核中的一个环状分子,同时可以有多个环状质粒DNA,是研究革兰氏阴性菌的转化与接合时良好的实验材料。然而,有关胞外多聚物的存在,对于大肠杆菌转化和接合效率的影响的报道至今尚不多见[5]。
针对以上情况,本项目拟以胞外多聚物的去除与否为核心,利用大肠杆菌的转化和三亲接合实验,来研究去除胞外多聚物对大肠杆菌转化和接合效率的影响,研究结果有望提出一条提高大肠杆菌人工转化的效率的新途径,以加强大肠杆菌的工程应用,并利用大肠杆菌工程菌株生产特定产物,并可为胞外多聚物组分对转化和接合的影响,胞外多聚物对外源基因吸收的影响等提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 化学试剂与培养基
实验试剂:CaCl2,E. coli DH5α菌株,E. coli Top10菌株,E. coli DH5α(pRK2013)菌株,E. coli DH5α(pBBR32245GFP,含外源GFP荧光基因片段)菌株,胰蛋白胨,酵母提取物,NaCl,甘油,AOEB双染试剂盒,pUC19质粒;
LB培养基(gL1):胰蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0,pH 7.0。固体LB培养基每升加入18 g琼脂粉。
CaCl2甘油:30%甘油溶液200 mL(灭菌)+ 0.2 M CaCl2溶液200 mL(灭菌)
1.2 所用菌株的抗生素抗性检验
1)将菌株从80 ℃冰箱中取出,置于冰上融化,在超净工作台上,使用用酒精灯灼烧过的接种针挑去少许保存菌液,在酒精灯火焰边使用接种针在无抗性平板上划线,倒置培养48 h。
2)将各菌株的单菌落点接于含有不同浓度的抗生素的LB平板(抗生素:链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素;浓度:10、25、50、75、100、200 mgL1)。以点接的不加抗生素的LB固体平板作为空白对照。于37 °C恒温静置培养48 h,观察培养皿中菌落生长情况。

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