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去除胞外多聚物(eps)对鞘氨醇杆菌接合效率的影响(附件)

2021-07-03 23:35编辑: www.51jrft.com51今日论文网
持久性有机污染物,包括多环芳烃(PAHs)、固醇类激素等的微生物降解早已成为当今环境科学研究的热门课题。鞘氨醇杆菌普遍具有降解芳烃等污染物的特性,是优良的芳烃污染环境修复菌。之前人们对微生物降解芳香族化合物的基因、代谢途径和调控手段等进行了系统地研究。能否有效的通过利用分子手段以提高优势基因在功能菌株中的克隆表达效率,将会极大程度影响功能菌株去除环境中持久性有机污染物的效率,从而影响人类健康和生态环境安全。基于鞘脂类菌属具有丰富的胞外分泌物的特点,对于去除EPS是否会影响外源基因通过接合作用进入鞘氨醇杆菌的研究尚不明朗。基于此,本研究探讨了去除EPS对鞘氨醇杆菌接合目的基因(绿色荧光蛋白基因gfp)效率的影响,同时为在实验室条件下更好地实现鞘脂类细菌的基因水平转移提供理论依据。实验选取本实验室拥有的鞘氨醇杆菌属的三株菌株RS1,RS2和ES2-1,首先验证三株受体菌的抗生素抗性及抗性浓度,明确功能菌株的抗性为RS1、RS2具有氨苄青霉素和链霉素抗性;ES2-1仅具有链霉素抗性。另外,本实验采用超声法去除三株受体菌的胞外多聚物,E.coli HB101(pBBR322-45GFP)为目的基因供体菌,E.coli DH5α(pRK2013)为辅助菌,与去除EPS前后的受体菌RS1,RS2和ES2-1分别做三亲接合实验,发现去除ESP的确可以在一定程度上提高鞘氨醇杆菌的结合效率。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1菌株抗生素抗性及抗性浓度实验 2
1.1.1材料2
1.1.2方法2
1.2松散型胞外聚合物(EPS)的去除 3
1.2.1材料3
1.2.2方法3
1.3所得菌体沉淀致死率的计算4
1.3.1材料4
1.3.2方法4
1.4所得上清液中EPS各组分的定量检测4
1.4.1多糖含量检测用苯酚硫酸法4
1.4.2蛋白含量检测用考马斯亮蓝法4
1.5三亲接合5
1.5.1材料5
1.5.2方法5
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1.6数据处理5
2 结果与分析6
2.1 三株受体菌的菌落、菌体形态以及分类学地位6
2.2 菌株RS1,RS2和ES21抗性标记的筛选6
2.3 超声法去除EPS过程对菌株RS1,RS2和ES21致死的影响7
2.4 所得上清液中EPS各组分的定量检测结果7
2.5 菌株RS1、RS2和ES21去除EPS前后的三亲接合效率7
3 讨论8
3.1 鞘脂类的研究进展及对接合的影响8
3.2 提取EPS的其他方法及研究的不足9
致谢9
参考文献9
去除胞外多聚物(EPS)对鞘氨醇杆菌接合效率的影响
引言
引言
胞外聚合物主要是由细菌、真菌、病毒和原生动物等微生物所产生[1]。天然环境存在大量的各种各样的微生物,能不断地通过新陈代谢释放EPS到环境中。研究表明,海洋环境中有多达50%可溶性有机质(DOM)是来自于微生物所释放的EPS[2]。胞外聚合物EPS主要由具有近生物源组分的活性多糖和蛋白质所构成,主要来源于微生物细胞代谢的分泌物、细胞自溶产生的聚合物、细胞脱落的表面物质 以及进水基质中的相关组分[3]。现有的研究表明,EPS的含量和组分对活性污泥的絮凝性能、沉降性能、脱水性能和重金属吸附性能有较大的影响[45]。
微生物细胞通过分泌EPS构筑一个供细胞居住的微栖息地(House of the biofilm cells),使得不同种的微生物细胞彼此靠近而生活在一个理想的小环境内。它们可以通过横向基因迁移(HGT,Horizontal gene transfer)的方式彼此交换基因信息[6]。已经报道的EPS中含有的基因组分大都来自于细胞破碎的eDNA组分,包含了关于细胞体的最重要信息[7]。这些EPS基质中的DNA片段能够通过细胞自然死亡后裂解的方式而被释放到EPS构筑的微栖息地中,通过宿主细胞所吸收整合到另一物种细胞内部实现基因横向迁移表达[8]。然而,目前并不清楚DNA在EPS基质中的转移过程以及EPS基质在横向基因迁移过程中的作用。
总之,胞外聚合物EPS是构成生物膜(Biofilms)、生物席(Microbial mats)、生物絮凝体(Aggregates)、胞外菌丝(Pili)、及活性污泥(Activated sludge)的最重要组分。在水微生物界面,粘附在细胞表面的分泌物充当水体与微生物细胞之间的界面介质,是联系细胞生理活动和外界水环境之间关系的纽带[9]。微生物作用下,污染物的降解、吸附、迁移转化、形态转化、以及微生物细胞间的基因信息的交换等行为,无一不首先受到微生物胞外聚合物影响[10]。
芳香化合物是环境中的常见污染物,利用生物方法去除这类污染物是较有前景的手段。鞘氨醇杆菌的广泛分布、其对复杂结构的难降解芳香化合物的特异降解作用[11],以及在生物聚合物的生产方面的优越性使其受到越来越多的关注。但是由于对其认识较晚,目前对鞘氨醇杆菌的研究多数停留在初级阶段,目前主要的报道多集中在该菌属菌株的分离,降解途经、降解条件优化以及降解产物的分析等方面,而去除EPS是否会影响外源基因通过接合作用进入鞘氨醇杆菌尚不清楚。基于此,本研究以鞘氨醇杆菌为例,探讨去除EPS对鞘氨醇杆菌接合效率的影响,研究结果可为在实验室条件下更好地实现鞘脂类细菌的基因水平转移提供理论依据。
1 材料与方法
1.1菌株抗生素抗性及抗性浓度实验
研究各菌株对各种抗生素的抗性,将菌株RS1,RS2和ES21点接于含有不同浓度的抗生素的LB平板(抗生素如庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素、壮观霉素、四环素还有其它的实验室已有抗生素,浓度:10、25、50、75、100 mgL1)。以点接的不加抗生素的LB固体平板作为阳性对照。于30℃恒温静置培养96 h,观察培养皿中菌落生长情况。明确功能菌株的抗性可为后期三亲结合利用抗生素作为筛选标记提供依据。
1.1.1 材料
菌株RS1,RS2和ES21,LB固体培养基(胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉),抗生素(庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、环丙沙星),玻璃平板若干,150mL锥形瓶若干,200μL枪及枪头,1000μL枪及枪头,5mL枪及枪头。

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