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f10家族木聚糖酶突变体表达纯化与动力学测定(附件)

2021-08-21 15:43编辑: www.51jrft.com51今日论文网
木聚糖(xylan)是一种通过β-1,4-糖苷键链接β-D-吡喃型木糖单元而构成主链的异质多糖(heteropolysaccharides),具有催化木聚糖降解功能的酶称作木聚糖酶,属于多糖水解酶。本实验将已有的木聚糖酶突变体通过基因操作获得酵母表达工程菌,在BGMY发酵培养基内进行培养表达,硫酸铵沉淀透析获得粗酶液,再通过Ni-NTA亲和层析与G75分子筛获得纯化的蛋白,纯化后的木聚糖酶突变体经过实验测定其最适温度、pH、温度稳定性、pH稳定性、动力学等。本实验的蛋白样品最适pH均为5-6之间,在4-10.6之间稳定性较强;YX-1的最适温度为75℃,YX-2的最适温度为80℃,YX-2的温度稳定性较好;动力学测定结果为两个蛋白样品的底物结合能力均明显高于CK。以上结果为后续相关研究提供理论依据,具有良好应用价值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 菌株与质粒2
1.1.2 培养基2
1.1.3 试剂2
1.1.4 仪器2
1.2 方法2
2 木聚糖酶突变体表达系统的构建2
2.1 突变体重组质粒的构建2
2.1.1 PCR扩增2
2.1.2 切胶回收3
2.1.3 转化子的获取3
2.1.4 结果与讨论3
2.2 酵母工程菌的构建3
2.2.1 质粒提取3
2.2.2 酶切4
2.2.3 清洁回收4
2.2.4 感受态的制备5
2.2.5 电转5
3 木聚糖酶突变体的表达及纯化5
3.1 木聚糖酶突变体的筛选5
3.1.1 转化子的挑选5
3.1.2 PCR扩增与测序验证6
3.1.3 碳源诱导表达6
3.1 *51今日免费论文网|www.51jrft.com +Q: ¥351916072¥ 
.4 酶活的测定验证 6
3.2 木聚糖酶突变体的表达 7
3.2.1 突变体菌种培养7
3.2.2 离心抽滤7
3.2.3 硫酸铵沉淀7
3.2.4 重溶7
3.2.5 透析7
3.3 蛋白纯化7
3.3.1 通过NiNTA亲和层析获得纯化的蛋白7
3.3.2 通过G75分子筛获得纯化的蛋白7
3.3.3 蛋白纯化后的SDSpage验证7
4 动力学测定8
4.1 最适pH的测定8
4.2 pH稳定性的测定9
4.3 最适温度的测定10
4.4 温度稳定性的测定10
4.5 动力学的测定11
5 结果与分析12
致谢13
参考文献13
图1 酶切前后电泳图5 图2 转化子酶活验证7
图3 纯化前后对比图8
图4 不同配方同样pH条件下蛋白的活性差异9
图5 蛋白的pH稳定性折线图9
图6 蛋白的最适温度折线图10
图7 温度稳定性CK图10
图8 温度稳定性YX110
图9 温度稳定性YX211
图10 CK动力学测定曲线图11
图11 YX1动力学测定曲线图12
图12 YX2动力学测定曲线图12
表2 PCR反应体系(基因片段)2
表2 PCR反应条件(基因片段)3
表3 PCR反应条件(转化子)6
F/10家族木聚糖酶突变体表达纯化与动力学测定
引言
引言
木聚糖是一种在植物的细胞壁中存在的异质多糖,是植物半纤维素的主要及重要组成成分,作为可再生资源在自然界中的含量仅次于纤维素[1]。
木聚糖酶在自然界当中的分布非常广泛,对于降解半纤维素起到重要作用[2]。木聚糖的具有相对复杂的结构,存在多种来源,并且每个来源的木聚糖的糖链结构往往具有较大的差异[3]。
由于真菌基因、蛋白组学等方面的发展,将蛋白导入真菌进行表达得到有效广泛的利用[4]。本实验将木聚糖酶在毕赤酵母中进行表达,选用GS115作为宿主菌。
由于木聚糖酶的广泛应用,国内外对于木聚糖酶的纯化研究不断改善,所以木聚糖酶有多种纯化方式,根据本实验的设备条件、实验需求等,本实验通过粗酶液提取、预处理、盐析、镍离子亲和层析和凝胶阻排色谱对木聚糖酶进行纯化。
在毕赤酵母内表达及纯化后的木聚糖酶进行酶学性质的研究检测。木聚糖酶野生型与突变体的酶学性质如最适pH、最适温度、温度稳定性等会存在差异[5]。从不同方面评价酶活性的特性,从而便可判断其适用条件,并得出其应用领域及可利用性的结论。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒
毕赤酵母GS115、大肠杆菌DH5α、目的基因片段YX1和YX2、表达载体空载质粒pPIC9k
1.1.2 培养基
(如未明显标注则均为1L体系)
LB培养基:蛋白胨(Tryptone)10g,酵母粉(Yeast extract)5g、NaCl 3g、ddH2O 1000mL,固体培养基则加入20g琼脂,分装完成后将其放入灭菌锅中115℃条件下灭菌30min。
BMGY培养基:酵母粉1%、蛋白胨2%、11.81g KH2PO4、3.01g K2HPO4、甘油1%、YNB 1.34%、4*105 Brotin(未加),(固体培养基则分装前在三角瓶中加入1.5%琼脂),按照需求分装后放入115℃灭菌锅中灭菌30min。
YPD培养基:酵母1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,ddH2O1000mL(固体培养基则分装前在三角瓶中加入1.5%琼脂),分装完成后放入115℃灭菌锅中灭菌30min。

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