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黑果枸杞花色苷与bsa相互作用及其机理研究

2021-06-03 20:58编辑: www.51jrft.com51今日论文网
运用高速逆流色谱法(High-speed Countercurrent Chromatography, HSCCC)从黑果枸杞中纯化1种纯度为95%以上的花色苷。通过实验室前期的物质鉴定分析,确认该花色苷为矮牵牛素3-O-芸香糖-5-O-葡萄糖苷(petunidin3-O-[rhamnopyranosyl-( trans-p-coumaroyl)]-5-O-(β-D-glucopyranoside),并在调节pH为7.4,温度为310K(模拟人体环境),运用荧光光谱分析法研究了LRM与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)之间的相互作用,并以自然界中最常见的C3G(cyanidin-3-glucoside)花青素与BSA的结合情况作为对照。使用Stern-Volmer 方程和修正后Stern-Volmer的方程计算出了LRM和BSA之间的猝灭常数结合常数Ksv、Ka和结合点位n,结果显示每个LRM分子和一个BSA进行了结合,并且该过程为静态猝灭。通过三维荧光光谱技术和恒波长同步荧光光谱法确定BSA蛋白结构的变化。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1实验原料与试剂4
1.2实验仪器与设备4
1.3实验方法4
1.3.1粗提取黑果枸杞花色苷4
1.3.2 HSCCC法制取花色苷单体5
1.3.3荧光分析所需溶液的配置5
1.3.4 HPLC分析物质成分5
1.3.5 LRM和C3G分别与BSA相互作用的荧光光谱分析5
2结果与分析6
2.1 LRM单体的分离纯化6
2.2 LRM和BSA之间的相互作用7
2.3 LRM对BSA的荧光猝灭机理分析8
2.4结合常数及结合位点数的确定9
2.5 LRM对BSA的3D荧光图谱分析10
2.6 LRM和BSA结合的同步荧光光谱分析11
3讨论12
3.1实验结论12
3.2研究展望12
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谢13
参考文献13
黑果枸杞花色苷与BSA相互作用及其机理研究
引言
引言
血清白蛋白具有分子量小,结构稳定的特点。它具备重要的生理功能,如内源性代谢物和外源性小分子的储存和运输。在探讨药物的药理作用中血清蛋白起着重要的作用。国内外研究一致表明,牛血清白蛋白(BSA)是研究小分子在血液中代谢情况和确定药物的药代动力学和药效学性质的最理想蛋白质模型[1]。
花色苷是由花青素与糖类物质以糖苷键连接而形成的类黄酮化合物,使被子类植物显示出不同的颜色,是广泛存在自然界中的一种天然多酚。在自然界中,最常见的花青素种类大致分为6种,分别是:矢车菊色素(Cyanidin)、牵牛花色素(Petunidin)、天竺葵色素(Pelargonidin)、锦葵色素(Malvidin)、飞燕草色素(Delphinidin)、芍药色素(Peonidin) [23] ,花青素作为一种无毒、可食用的天然色素,具有很高的药用价值和食用价值[4]。黑果枸杞相比红果枸杞富含更多的花青素,体外抗氧化性实验表明黑果枸杞中提取出的花色苷类物质具有远高于VC和其他花色苷的抗氧化性,成熟的黑果枸杞中中富含多类花色苷,研究黑果枸杞中的花色苷类物质有极高的商业价值 [5],经过唐骥龙等[6] 的前期研究表明:通过AKTA Purifier蛋白纯化系统从黑果枸杞得到的一种高纯度花色苷,运用NMR和MS技术鉴定了该花色苷的物质结构,简称为LRM,并且体外抗氧化活性分析表明该花色苷具有极高的抗氧化性,而高速逆流色谱法相比ATKA Purifier纯化系统有更高的提取效率[7], 研究LRM与BSA的结合作用对于LRM在体内的生化作用研究提供了重要的依据。
1 材料与方法
1.1 实验原料与试剂
黑果枸杞鲜果:国家枸杞工程技术研究中心资源圃 宁夏银川(贮藏环境为20℃);
矮牵牛素类花色苷LRM:由实验室制备,纯度大于95%;
三氟乙酸(TFA)美国 Sigma 公司;
CH3CN、CH3OH、HCOOH用于液相色谱的流动相配置 进口分装,色谱纯;
CH3(CH2)3OH、CH3OC(CH3)3等其他试剂 均为购于国药公司,国产分析纯。
1.2 实验仪器与设备
AY120/BL220H型电子天平 Shimadzu 日本;
真空旋转蒸发仪 Heidolph 德国;
HH4数字恒温水浴锅 国华电器有限公司 常州;
TelstarLyoQuest 冻干机 Telstar 西班牙;
EPEDE210TH 超纯水制备机 益普科技发展有限公司 南京;
Agilent1100高效液相色谱仪 美国 Agilent公司
TSKgel ODS80 TsQA色谱柱(4.6250 mm) Tosoh 日本;
YMCPACKODSA色谱柱(20250mm,5m) YMC 日本;
F7000荧光分光光度计 Hitachi 日本;
TBE300A高速逆流色谱 同田生化科技有限公司 中国上海
1.3 实验方法
1.3.1 粗提取黑果枸杞花色苷
称取适量的新鲜黑果枸杞,以1: 40(m / V)为料液比加入体积分数为80%乙醇(添加0.1%HCOOH调节环境为酸性)。设定水浴温度为50℃,进行3 h水浴加热。将黑果枸杞提取物过滤后,设置温度为40℃将滤液进行旋转蒸发。待滤液干燥后,用含有0.5%TFA的去离子水将其稀释至30mL。取10ml旋蒸液,上样于AB8大孔树脂层析柱(5cm×30cm)并先用两个柱床体积的超纯水进行洗脱。然后使用分析纯乙醇溶液(酸性环境,pH=2.0)以2 mL / min的流速进行洗脱。多次上样,因为花色苷在酸性环境下呈深紫色,收集深紫色洗脱液并使用真空旋转蒸发器悬蒸。将干燥后的粗品花色苷放于离心管中于4℃保存,每次使用时用超纯水溶解。
1.3.2 HSCCC法制取花色苷单体
以水150ml、正丁醇300ml、甲基叔丁基醚300ml、乙腈750ml、三氟乙酸1.5ml配置溶剂体系(V/V,流动相配比为1:2:2:5:0.001)。进行超声脱气40min,放入25℃环境中避光保存8h以上,可看出溶剂体系分为两层。其中上层为固定相,下层为流动相。

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